第三节　维生素D受体作用的分子机制

维生素D是一类脂溶性类固醇激素，1，25（OH）₂D是具有活性功能的维生素D，由胆固醇转化为维生素D前体7-脱氢胆固醇以及酵母细胞中的麦角固醇，经270～315nm紫外线照射后被激活，分别转化为维生素D₃（cholecalciferol，胆骨化醇）及少量维生素D₂（calciferol，麦角骨化醇）。再经过肝、肾组织中的羟化酶两次羟化作用，转化为具有活性的1，25（OH）₂D，活性1，25（OH）₂D与其受体（vitamin D receptor，VDR）结合后发挥广泛的生物学作用。VDR是核受体家族中的重要成员，广泛存在于各种组织和器官中。

被吸收后的维生素D进入血液，与维生素D转运蛋白（α-球蛋白部分）、维生素D结合蛋白（vitamin D-binding protein，DBP）以及β-脂蛋白结合，在血液中运输。当维生素D被从血液中转运到肝脏后，25羟化酶（P450C25）在第25位C加上羟基，近来研究发现皮肤和肠道也存在25羟化酶，成为25（OH）D，是维生素D的主要循环形式，作为储存器官的肝外组织如脂肪也可摄取维生素D及25（OH）D，当靶器官需要时缓慢释放出来。25（OH）D的第一位碳元素在肾脏1α羟化酶（P₄₅₀C1）的作用下被再次羟化，转变为1，25（OH）₂D，为维生素D的生物活性形式。

1，25（OH）₂D和25（OH）D的分解代谢首先是在23-C被羟基化，接着侧链26-C被羟化，最终生成25（OH）D-26，23-内酯，这条降解通路主要发生在人和豚鼠。在人类还有另一条降解途径是，首先启动侧链24碳（24-C）断裂途径，在24羟化酶（P₄₅₀C24）的作用下生成24-C羟化物，然后被氧化成24C-OXO（羰基）的降解途径，接着形成羟基化C23-OH/C24-OXO复合物，侧链裂解成C23，氧化成C23羧酸。1，25（OH）₂D氧化过程的C-24通路，最后合成水溶性氧化终产物维生素D-23C-OXO（羧酸）在肾脏被过滤和排出体外。

一、1，25（OH）₂D/VDR的基因组和非基因组机制

VDR介导的1，25（OH）₂D的调节机制分为基因组和非基因组两种方式，VDR的核受体信号转导机制，调节基因的转录；并通过非基因的受体位于细胞膜，调节复杂的信号系统包括快速开通钙通道。基因组和非基因途径在多种类型的细胞中同时并存，非基因组作用可能在VDR的激素调控中扮演更重要角色，会产生快速生理作用。

VDR介导的1，25（OH）₂D基因组机制：VDR几乎分布在所有组织器官中，具有广泛的生理功能。维生素D受体（VDR）是由6个功能域组成，每个功能域分工不同但又相互协调。配体结合域介导与1，25（OH）₂D的结合并与视黄酸X受体（RXR）形成异二聚体，DNA结合域则通过两个锌指结构选择性地识别靶基因启动子上的三个核苷酸（DR3）型维生素D反应元件（VDRE），并由此改变局部DNA的构象，在其他协同转录激活／抑制因子和AF-1、AF-2两个亚区的共同参与下激活转录过程以及下游基因的表达。

VDR介导转录激活是通过它与靶基因上的DNA特异性核苷酸序列，即维生素D反应元件（VDRE）相互作用来实现的。VDRE一般存在于靶基因的启动子区或调控序列。经典的VDRE以6个碱基GGGTGA构成半位点为核心，形成以3个核苷酸为间隔的不完全直接重复，即重复DR3反应元件或形成以9个核苷酸为间隔的反转回文结构。外翻重复并带有DR3间隔六个核苷酸（ER6）序列的VDRE是最常见的。

迄今已发现多种不同的VDRE，其核苷酸顺序微小的变化就会影响与VDR的结合，从而改变靶基因对1，25（OH）₂D的反应。多数情况下VDR是以VDR-RXR二聚体复合物的形式与VDRE结合，VDR结合于VDRE 3’端的半位点，RXR结合于5’端的半位点。当VDRRXR与VDRE结合后，部分靶基因VDRE处的DNA出现从水平位置向上弯曲约55°，这一构象改变的确切生理意义尚不十分清楚，但这种构象改变能够对VDR的功能产生影响，并是导致VDR对某些靶基因产生转录抑制而不是转录激活的重要原因之一。在VDR-RXR与VDRE结合以后，VDR是如何改变RNA聚合酶起始转录的机制尚不完全清楚，但可以肯定的是，在受体与转录前起始复合物之间存在蛋白质-蛋白质的相互作用。应用酵母双杂交体系和谷胱甘肽S转录酶蛋白结合分析等分子生物学技术，现已证明VDR与转录因子ⅡB（transcription factorⅡB，TFⅡB）之间存在高度特异的直接联接。TFⅡB的羧基端与VDR的配体结合区联接，并作为VDR与转录前起始复合物之间相互联系的枢纽。这样，VDR与TFⅡB的结合就导致其他基础转录因子聚集到前起始复合物中来，或者通过改变转录前起始复合物的构象影响靶基因的转录速率。迄今已发现被VDR调控转录的基因有：编码甲状旁腺激素、1型胶原、心房利钠肽、IL-2、肾素、骨涎蛋白以及中性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等的基因。

VDR介导的1，25（OH）₂D的非基因组机制：定位在膜系统上的VDR与配体结合后，通过激活质膜微囊途径在信号转导时产生快速反应，与上述传统的VDR介导的需要几小时到几天的基因组转录调控不同，这些快速反应经常是在1～45分钟内产生的，并且可以被抑制剂拮抗，调节蛋白质修饰，产生生物学功能，如可以通过激活PKC或MAP激酶调节胰岛素分泌和钙、氯离子通道开闭的调节。烧瓶状的膜内陷微囊是许多快速反应信号转导的来源，因其中富含鞘脂和胆固醇，对维生素D和其他类固醇激素如雌、雄激素均有很强的亲和力。当1，25（OH）₂D-VDR复合物为规则的形状时，可以与膜微囊结合，发挥快速反应作用。而当1，25（OH）₂D-VDR复合物是碗状形状时，VDR与RXR形成异源二聚体，结合到下位基因的VDRE区域再通过招募共激活因子或抑制因子复合物，激活VDR-RXR-DNA调控编码，执行传统的基因转录功能，包括刺激肠道钙和磷酸盐的吸收，从而影响骨骼和矿物质离子稳态。

二、1，25（OH）₂D/VDR的磷酸化与转录活性

磷酸化与去磷酸化是许多转录因子活性调节的方式之一，核受体的磷酸化明显影响DNA结合、配体结合、二聚体形成、核定位及转录激活等功能。磷酸化主要发生在核受体的配体结合域（LBD）的丝氨酸残基上。Ser-51是蛋白激酶C（PKC）在体外和体内磷酸化VDR的位点。Ser-51突变明显抑制维生素D激素的转录激活，提示PKC磷酸化Ser-51在维生素D依赖性转录激活中发挥重要作用。研究人员用蛋白激酶C抑制剂staurosporin（ST）和丝-苏氨酸磷酸酶抑制剂冈田酸（okadaic acid，OA）干扰VDR的磷酸化路径，以便了解VDR磷酸化对其转录活性的影响，结果表明，ST和OA均可阻止由VDRE介导的VDR转录活性，但两者发挥作用的机制不尽相同。OA通过抑制VDR-RXR的结合发挥作用，同时影响VDR转录后的去磷酸化过程，而ST干扰VDR磷酸化效应后影响基因的转录，与VDR的水平以及VDR-RXR与VDRE的结合无关。

三、1，25（OH）₂D/VDR对骨的分解及合成代谢机制

维生素D对骨的分解代谢和合成代谢作用起非常重要的作用，高水平的1，25（OH）₂D有利于肠的代谢／吸收。维生素D过多也会引起骨矿物质丢失，1，25（OH）₂D动员骨组织里的钙和磷释放入血液，以维持正常的血钙浓度。这一作用可能是1，25（OH）₂D通过核受体诱导干细胞分化为成熟的破骨细胞以及破骨细胞活性增加，继而调节骨吸收，释放骨钙进入血液，一旦破骨细胞成熟，VDR即不再对1，25（OH）₂D产生反应。1，25（OH）₂D增加成骨细胞碱性磷酸酶的活性及骨矿化相关基因的表达。当细胞外钙、磷浓度超饱和时，1，25（OH）₂D才对维持钙磷浓度和促进矿化发挥作用。低水平的1，25（OH）₂D通过VDR信号促进骨形成的作用，可能引起成骨细胞的增殖。生理状态下，通过VDR基因信号通路直接作用在骨骼上，平衡骨形成与骨吸收。维生素D不足或过量对骨都是不利的，在维生素D缺乏时通过PTH信号通路发生作用，而当维生素D过量时则通过RANKL通路发生作用。

四、1，25（OH）₂D/VDR对肠道的作用机制

1，25（OH）₂D-VDR基因信号通路最重要的生理作用仍然是促进钙、磷在肠道的吸收，特别是在限制钙、磷饮食的时候。维生素D对小肠上皮的主要作用是刺激钙的吸收。1，25（OH）₂D可诱导钙结合蛋白（calcium-binding protein，CBP）的表达。钙结合蛋白在小肠黏膜细胞促进钙的转运，1，25（OH）₂D还能增加刷状缘碱性磷酸酶的活性，促进磷酸酯键的水解和磷的吸收。1，25（OH）₂D-VDR在十二指肠分别通过活化和抑制跨细胞和旁细胞路径对钙的吸收发挥调节作用，其中抑制旁细胞路径主要发生在未断奶的婴儿、衰老的动物及钙摄入量很高时。而主动跨细胞转运途径主要发生在儿童、成长期动物、适量钙饮食时。钙三磷腺苷酶由ATP2C2基因编码，1，25（OH）₂D诱导肠细胞ATP2C2基因的表达，从而增加钙ATP酶通过CaBP9转运钙或通过碱性磷酸酶替代钙 ATP酶的作用。在肠上皮细胞中，1，25（OH）₂D诱导体内钙的吸收，然后碱性磷酸酶的mRNA和蛋白表达水平升高。碱性磷酸酶在钙转运中的作用是次要的，钙ATP酶则更为重要，它编码一种膜蛋白，并受1，25（OH）₂D的调控。在低钙条件下，1，25（OH）₂D通过结合VDR的同时在TRPV6和CaBP9k的共同参与下调控肠道上皮中钙的运输。VDR通过抑制肠道黏膜凋亡，对感染性肠病有治疗作用及对肠道屏障产生保护作用。

五、1，25（OH）₂D/VDR在肾脏的作用机制

在正常血钙浓度下（9.5mg/dl），肾脏组织中1α羟基化酶与24羟基化酶均具有活性，因此既能够合成1，25（OH）₂D，也能够合成24，25（OH）₂D，活性维生素D的产生和降解达到平衡，而血清钙浓度降低时，刺激1α羟基化酶的活性增加，而当血清钙浓度较高时明显抑制此酶活性，由此可以调节1，25（OH）₂D的合成量。1，25（OH）₂D合成较多时，甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）水平会反应性降低，从而导致 24，25（OH）₂D 的合成量增多。1，25（OH）₂D可以直接作用于肾脏，促进肾小管对钙磷的重吸收，减少尿中的丢失。肾脏中1位羟基化酶与24位羟基化酶的活性相互抑制，对血钙水平的平衡发挥重要作用。维生素D在肾脏近端小管经过CYP27B1酶催化产生1，25（OH）₂D₃，在低钙条件下，PTH诱导CYP27B1酶的活性及表达，产生更多的活性维生素D。

成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor 23，FGF-23）是磷调节因子，结合不同的FGF受体（分别为FGFR3／4和FGFR1），可增加尿磷的排泄；显著抑制1α羟化酶（Cyp27b1）活性，增加24羟化酶（Cyp24α1）的活性，因而降低 1，25（OH）₂D；α-Klotho蛋白是与抗衰老相关的跨膜蛋白，主要在肾小管表达，作为辅助因子参与FGF受体（FGFR）的组成，提高结合FGF-23的亲和力。促进钙重吸收，抑制磷重吸收。活性维生素D在近端小管直接作用于VDR刺激磷酸盐重吸收与FGF-23和α-Klotho表达变化有关。在远端肾小管，1，25（OH）₂D诱导TRPV5进行钙转运，类似于TRPV6在小肠中的作用。在远端肾小管，1，25（OH）₂D诱导CaBP28k的表达方式类似肠内诱导CaBP9k的表达及功能。远端肾小管在低钙条件下，1，25（OH）₂D可以诱导TRPV5基因的表达，通过PMCA1b把钙转移到血液，最终实现NCX1钠／钙交换。VDR信号系统可以调节α-Klotho、Wnt等通路同时抑制肾素系统对足细胞的保护，拮抗糖尿病的损害。

六、1，25（OH）₂D/VDR在皮肤上的作用

皮肤毛囊中高表达VDR，VDR敲除小鼠表现出脱发症和皮肤囊肿的现象。体表的毛囊组织不断自我循环，是形成于胚胎期的器官，由角质形成细胞和真皮乳头细胞组成，出生后逐渐成熟。VDR对开启毛囊生长周期、维持其角质细胞功能有重要作用。对毛囊生长周期起作用的VDR结构是DNA结合区和活性功能2区。VDR调节毛囊生长周期不需要配体1，25（OH）₂D的结合，因为VDR敲除鼠在出生后毛发脱落以后，再没有毛发的启动，而1α羟化酶敲除鼠有毛发生长。但是，维生素D及其类似物对毛囊确实发挥一定的作用。VDR基因的共抑制基因无毛基因（HR）、共激活基因MED1以及RXRa二聚配体受损时都可能导致毛发受损、脱落。VDR以非经典途径的方式调节毛囊生理，主要涉及Wnt信号和Shh信号通路，这两条信号转导通路与癌症的发生、发展关系密切。

七、1，25（OH）₂D/VDR的抗肿瘤作用机制

1，25（OH）₂D/VDR具有抗增殖与促分化作用，抗增殖作用主要是通过调控肿瘤细胞的细胞周期，抑制G0/G1期向S期转化，涉及作用靶点包括调控细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）和 CDK 抑制剂（CKIs）等。用 1，25（OH）₂D₃对人乳腺癌MCF7细胞进行处理后，细胞内p21和p27表达同时增加，而细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）、CCND3、CCNA1和CCNE1的表达受到显著抑制，同时抑制CDK的活性和Rb的磷酸化。1，25（OH）₂D/VDR还通过调节细胞增殖相关的抑癌基因FOXO、细胞周期抑制蛋白RBL2（Rb-like protein p130）和RBBP6（Rb-binding protein 6）等影响细胞增殖。调节β-连环蛋白（β-catenin）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等相关信号通路，以及多种转录因子等促进肿瘤细胞的分化。

1，25（OH）₂D/VDR 通过调控促凋亡蛋白 BAX、BAK、BAD 和／或抗凋亡蛋白 BCL2、BCLXL的平衡诱导细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞的存活和生长，还能通过直接激活caspase、上调MEKK-1等方式引起肿瘤细胞的凋亡。1，25（OH）₂D/VDR还可降低促进肿瘤细胞生长、侵袭和血管生成的外基质蛋白tenascin-C（肌腱蛋白C）的表达。直接抑制主动脉或肿瘤起源的血管内皮细胞的增殖，并阻断血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）诱导的内皮细胞的分支和延伸。

八、1，25（OH）₂D/VDR的其他作用机制

1，25（OH）₂D在肺内拮抗ang-2-tie-2-mlc和肾素-血管紧张素系统以改善VDR敲除小鼠的肺损伤程度；1，25（OH）₂D₃以VDR的剂量依赖方式刺激脂肪组织瘦素基因表达；VDR能够上调脑组织中枢的肾素和血管紧张素Ⅱ，以及血管紧张素Ⅱ介导的肠道NHE3表达，从而对机体的饮水量和尿量产生调节；1，25（OH）₂D通过其受体介导C-Met参与氧化应激、细胞衰老和衰老相关的分泌，如肝细胞生长因子。

总之，VDR介导的1，25（OH）₂D作用机制，由于其受体的广泛分布和形态多样性，对靶器官调控作用的多样、复杂性机制，还有很多的分子机制有待进一步研究和更新，相信随着现代科技的发展对VDR的研究会更加清楚、明确。

（孔　娟）

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