第二部分　细胞遗传学实验

实验七　植物细胞有丝分裂及染色体行为观察

【实验目的】

（1）了解植物细胞周期中染色体的动态变化；

（2）掌握植物染色体玻片标本的制备技术；

（3）熟悉细胞有丝分裂的全过程，重点是分裂中、后期染色体变化的特征。

【实验原理】

1.细胞有丝分裂

细胞分裂是生物个体生长和生命延续的基本特征。在高等植物中，有两种主要的细胞分裂方式，即有丝分裂和减数分裂。有丝分裂是植物个体生长和分化的基础，也是植物细胞增殖的主要方式。在有丝分裂过程中，每次核分裂前必须进行一次染色体的复制。在分裂时，每条染色体分裂为两条子染色体，精确地平均分配到两个子细胞中去，从而使产生的两个子细胞与其母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。由于染色体上有遗传物质DNA，因而在生物的亲代和子代之间保持了遗传性状的稳定性。染色体的这种特异性、恒定性、连续性和在细胞分裂过程中的正确复制及分配被确认是遗传物质的载体，是遗传传递规律的细胞学基础。可见，细胞的有丝分裂对于生物的遗传有重要意义。

2.植物材料预处理

高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点、幼叶等部位的分生组织，其中根尖因取材容易、操作和鉴定方便，被广泛利用。染色体常规压片技术是观察植物染色体常用的方法，该技术以分裂旺盛的根尖细胞为材料，经预处理、固定、解离、染色和压片等程序，可在显微镜下观察到大量处于有丝分裂不同时期的细胞和染色体，以便进行有关研究。

在正常情况下固定的根尖材料中，由于细胞分裂的中期持续时间很短而发现的分裂相较少，而且即使是处于分裂中期的细胞，由于染色体紧密排列于赤道面上，因而很难将染色体分散开来，不利于进行染色体计数和形态观察。为了克服这一困难，一般采用化学或物理的方法对植物材料进行预处理。预处理可以阻碍细胞分裂中纺锤体的形成，但并不影响分裂前期细胞的正常分裂，因此使得细胞分裂停止在中期，这样便可以获得较多的中期分裂相。同时，预处理的作用还可以使染色体收缩变短，在制片过程中更易分散。常用的预处理药物有0.01%～0.2%的秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002～0.004mol/L的8-羟基喹啉、饱和α-溴苯等。预处理时，将根尖直接浸泡在药液中，在适宜的温度下处理一定的时间（表7-1），即可取得较好的效果。很多植物的染色体计数和组型分析都是采用预处理技术，并结合植物染色体的常规压片技术完成的。

3.染色压片法

为了能够在显微镜下观察到清晰的染色体，还需对染色体标本进行染色，较好的染色方法有铁矾-苏木精、卡宝品红、乙酸洋红等染色压片法。其中以卡宝品红染色法最为简便、快捷。

（1）铁矾-苏木精染色压片法　先将根尖放入4%铁矾水溶液中媒染2～4h，流水冲洗20min，洗净附着的铁矾后转入0.5%苏木精染液（配制方法见附录2）中避光染色40～120min，使染色稍深。染后经自来水洗几次，在水中可加几滴氨水，以使着色蓝化。这时材料变得较硬且脆，因此需要放在45%乙酸中进行软化和分色，分色后应随时镜检。取染色适中的根尖置于载玻片上，用刀片将根尖分生组织切成薄片（越薄越好），滴1滴45%冰乙酸，加盖玻片后利用解剖针轻敲盖玻片，使材料呈云雾状即可镜检。

（2）卡宝品红染色压片法　固定好的材料经解离后，用蒸馏水冲洗后，将根尖置于干净的载玻片中央。用刀片切下根尖分生组织区，将其切成薄片，滴一滴卡宝品红染液（配制方法见附录2），染色10～15min，盖上盖玻片压片后镜检。

（3）乙酸洋红染色法　取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在一张干净的载玻片中央。用刀片将根尖分生组织切下，将其切成薄片，滴1滴2%乙酸洋红染液（配制方法见附录2），盖上盖玻片，进行压片。方法同铁矾-苏木精压片法。也可以采用十字交叉压片法。即：取根尖放在吸水纸上吸去多余的保存液，然后放在干净的载玻片中央。用刀片将分生组织切下，将其切成薄片。取另一张干净的载玻片，呈十字形交叉盖在放有材料的载玻片上。在载玻片上盖一张吸水纸，并用大拇指压片，使材料压成一薄层。然后将两载玻片分开，各滴加1滴染色液进行染色。稍停片刻后加上盖玻片，在酒精灯上轻烤一下片子，一手固定盖玻片，另一手用铅笔橡皮头对准材料轻轻敲打，使根尖细胞分散均匀。

【实验用品】

1.实验材料

洋葱（Aillum cepa）鳞茎，蚕豆（Vicia faba），小麦种子等。

2.实验器具

光学显微镜、培养箱、恒温水浴锅、温度计、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、滴管、烧杯、吸水纸。

3.试剂

卡诺固定液、卡宝品红染色液、0.002mol/L 8-羟基喹啉水溶液、0.05%～0.2%秋水仙素溶液、对二氯苯饱和水溶液、1mol/L HCl、加拿大树胶等。实验所用的固定液、染液及所用溶液的配制方法见书后附录。

【实验步骤】

1.根尖材料培养

（1）培养洋葱根尖　选取底盘大的洋葱作生根材料，剥去外层老皮，用刀削去老根，注意不要削掉四周的根芽。将洋葱鳞茎置于盛水的小烧杯（或广口瓶）上，让洋葱的底部接触杯内的水面。把小烧杯放进20～25℃培养箱内培养。培养时注意每天换水1～2次，防止烂根。待根长约1.5cm时，在上午9时取健壮的根尖进行预处理。

（2）种子培养根尖　选取蚕豆（或小麦）种子放在烧杯中，放清水浸泡过夜，使种子吸水胀大后倒出，再用清水洗几次，用多层纱布包好种子，放进20～25℃培养箱内培养。当根尖长1～1.5cm时，即可以在上午9时取生长旺盛的根尖进行预处理。

2.预处理

为了有利于细胞有丝分裂中染色体的观察和计数，使染色体缩短、分散，形态结构稳定，便于压片。在材料固定之前利用秋水仙素等药液对根尖材料进行预处理，以阻止或破坏纺锤体微管的形成，使有丝分裂过程被抑制在分裂中期阶段，以便累积较多的处于分裂中期的分裂相；同时改变细胞质的黏度，使染色体高度浓缩、变短，利于染色体的分散。预处理一般在分裂高峰前处理1.5h以上。处理的方法如下。

（1）秋水仙素水溶液　常用浓度为0.1%的秋水仙素溶液，室温下浸泡根尖材料3～4h。对抑制纺锤体活动的效果明显，易获得较多的中期分裂相，并且染色体收缩较直，有利于对染色体结构的研究。

（2）对二氯苯饱和水溶液　室温下处理3～5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体的效果也较好，对染色体小而多的植物，计数染色体制片效果最好。

（3）8-羟基喹啉水溶液　使用浓度为0.002mol/L，一般认为它将引起细胞黏滞度的改变，进而导致纺锤体活动受阻。通常处理2～4h，可使中期染色体在赤道面上保持其相应的排列位置，另一优点是处理后的缢痕区较为清晰。

（4）冰冻预处理　将根尖浸泡在蒸馏水中，置于1～4℃冰箱内或盛有冰块的保温瓶中冰冻24h。这种方法对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，效果良好，简便易行，各种植物都适用。

3.固定

通常采用的是卡诺固定液。固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。固定时，将预处理及作为对照的种子/根尖水洗两次，移入卡诺固定液中（固定液量约为材料的10倍，一个容器中所装的材料不能太多，温度不能太高），室温处理2～24h。固定后的材料若不及时使用，可经过95%乙醇冲洗后再转入70%乙醇中，置于冰箱内4℃保存备用，保存时间最好不要超过2个月。

4.解离

解离的目的是使分生组织细胞之间的果胶质层水解掉，并使细胞壁软化，便于压片。解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。一般方法是：将固定后（或保存后）的根尖分装到小烧杯内，用蒸馏水漂洗，再加入1mol/L HCl溶液，在60℃下水解8～10min（洋葱用8min，蚕豆侧根用10min），解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。

5.染色及压片

将解离后的根尖用蒸馏水换洗3次，每次5min，将解离液及其解离出的可溶性物质彻底洗净。漂洗时间和次数一定要足够，否则会影响染色效果或染不上色。

将解离漂洗后的根尖放在小培养皿里，取根尖放在洁净的载玻片上，可见根尖顶端有一段乳白色的组织，即为分生组织。用刀片切取1mm左右的分生区，其余部分弃掉，加1滴卡宝品红染液，染色10min。加盖玻片后，用镊子在有材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸，用拇指适当用力下压，用解剖针敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，使材料分散成薄薄的一层，以盖玻片不破裂为准。

【预期实验结果辨析】

有丝分裂是连续、动态的过程，一般分为间期、前期、中期、后期、末期五个时期。彩图7-1显示洋葱根尖的有丝分裂过程，在这五个时期中染色体呈连续、动态的变化。在光学显微镜下我们主要根据染色体的收缩程度、集结情况来确定一个细胞所处的分裂时期。

间期的染色体呈细线状，不能彼此分辨，存在核仁（但如果用改良的卡宝品红染液染色则无法显示）。前期是从间期向中期过渡的时期，染色体从细长不可见到粗短可见，核仁仍存在。前期与间期的区别在于其染色体较间期粗，但早前期染色体仍不能识别，晚前期染色体粗细接近中期，但比中期染色体长。中期染色体收缩到最粗最短，由纺锤丝牵引排在赤道板上，较容易识别。后期最明显的特征是两团染色体向两极拉开，但又没有到达两极。末期两团染色体到达两极，其特征性的结构是可以看到细胞板的形成。彩图7-1显示洋葱根尖有丝分裂不同时期的典型分裂相。

【要点及注意事项】

（1）压片时材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地。

（2）用解剖针敲打盖玻片时，要用力均匀，避免盖玻片破裂。

【作业及思考题】

（1）固定液的作用是什么？在使用固定液时应注意什么？

（2）预处理的作用是什么？

（3）在你观察的细胞分裂过程中，哪些分裂时期最多，为什么？

（4）直接固定和经过预处理后固定的材料，其分裂相有何不同？

【参考文献】

[1] 杨大翔.遗传学实验[M].第3版.北京：科学出版社，2016.

[2] 牛炳韬，孙英莉.遗传学实验教程[M].兰州：兰州大学出版社，2014.

[3] 赵凤娟，姚志刚.遗传学实验[M].第2版.北京：化学工业出版社，2016.

[4] 仇雪梅，王有武.遗传学实验[M].武汉：华中科技大学出版社，2015.

（唐文武　陈刚）