第二节　酶蛋白侧链的修饰

蛋白质侧链上的功能基主要有氨基、羧基、巯基、咪唑基、酚基、吲哚基、胍基、甲硫基等。修饰上述每一种功能基都有好多种试剂可供利用，这里不能详细介绍，只介绍那些应用广泛，又能达到某种特殊目的的试剂。好多试剂不是特别专一的。

根据化学修饰剂与酶分子之间反应的性质不同，修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等类型。下面介绍化学修饰氨基酸残基的主要常用试剂。

一、羧基的化学修饰

目前有几种修饰剂与羧基的反应，其中水溶性的碳二亚胺类特定修饰酶的羧基已成为最普遍的标准方法（如图3-1所示），它在比较温和的条件下就可以进行。但是在一定条件下，丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反应。

二、氨基的化学修饰

赖氨酸的ε-NH2以非质子化形式存在时亲核反应活性很高，因此容易被选择性修饰，方法较多，可供利用的修饰剂也很多，如图3-2所示的部分修饰方法。

氨基的烷基化已成为一种重要的赖氨酸修饰方法，修饰剂包括卤代乙酸、芳基卤和芳香族磺酸。在硼氢化钠等氢供体存在下酶的氨基能与醛或酮发生还原烷基化反应，所使用的羰基化合物取代基的大小对修饰结果有很大的影响。

氰酸盐使氨基甲氨酰化形成非常稳定的衍生物是一种常用的修饰赖氨酸残基的手段，该方法的优点是氰酸根离子小，容易接近要修饰的基团。

磷酸吡哆醛（PLP）是一种非常专一的赖氨酸修饰剂，它与赖氨酸残基反应，形成希夫碱后再用硼氢化钠还原，还原的PLP衍生物在325nm处有最大吸收，可用于定量。在蛋白质序列分析中氨基的化学修饰非常重要。用于多肽链N末端残基的测定的化学修饰方法最常用的有2，4-二硝基氟苯（DNFB）法、丹磺酰氯（DNS）法、苯异硫氰酸酯（PITC）法。其中三硝基苯磺酸（TNBS）是非常有效的一种氨基修饰剂，它与赖氨酸残基反应，在420nm和367nm能够产生特定的光吸收。

三、精氨酸胍基的修饰

具有两个临位羰基的化合物，如丁二酮、1，2-环己二酮和苯乙二醛是修饰精氨酸残基的重要试剂，因为它们在中性或弱碱条件下能与精氨酸残基反应（图3-3）。精氨酸残基在结合带有阴离子底物的酶的活性部位中起着重要的作用。还有一些在温和条件下具有光吸收性质的精氨酸残基修饰剂，如4-羟基-3-硝基苯乙二醛和对硝基苯乙二醛。

四、巯基的化学修饰

巯基在维持亚基间的相互作用和酶催化过程中起着重要的作用。因此，巯基的特异性修饰剂种类繁多。如图3-4所示。巯基具有很强的亲核性，在含半胱氨酸的酶分子中是最容易反应的侧链基团。烷基化试剂是一种重要的巯基修饰剂，修饰产物相当稳定，易于分析。目前已开发出许多基于碘乙酸的荧光试剂。马来酰亚胺或马来酸酐类修饰剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物。N-乙基马来酰亚胺是一种反应专一性很强的巯基修饰剂，反应产物在300nm处有最大吸收。有机汞试剂，如对氯汞苯甲酸对巯基的专一性最强，修饰产物在250nm处有最大吸收。5，5'-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Ellman试剂）也是最常用的巯基修饰剂，它与巯基反应形成二硫键，释放出1个2-硝基-5-硫苯甲酸阴离子，此阴离子在412nm处有最大吸收，因此能够通过光吸收的变化跟踪反应程度。虽然目前在酶的结构与功能研究中半胱氨酸的侧链的化学修饰有被蛋白质定点突变的方法所取代的趋势，但是Ellman试剂仍然是当前定量酶分子中巯基数目的最常用试剂，用于研究巯基改变程度和巯基所处环境，最近它还用于研究蛋白质的构象变化。

五、组氨酸咪唑基的修饰

组氨酸残基位于许多酶的活性中心，常用的修饰剂有焦碳酸二乙酯（DPC，diethylpy-rocarbonate）和碘乙酸（图3-5），DPC在近中性pH下对组氨酸残基有较好的专一性，产物在240nm处有最大吸收，可跟踪反应和定量。碘乙酸和焦碳酸二乙酯都能修饰咪唑环上的两个氮原子，碘乙酸修饰时，有可能将N-1取代和N-3取代的衍生物分开，观察修饰不同氮原子对酶活性的影响。

六、色氨酸吲哚基的修饰

色氨酸残基一般位于酶分子内部，而且比巯基和氨基等一些亲核基团的反应性差，所以色氨酸残基一般不与常用的一些试剂反应。

N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以修饰吲哚基，并通过280nm处光吸收的减少跟踪反应，但是酪氨酸存在时能与修饰剂反应干扰光吸收的测定。2-羟基-5-硝基苄溴（HNBB）和4-硝基苯硫氯对吲哚基的修饰比较专一（图3-6）。但是HNBB的水溶性差，与它类似的二甲基（-2-羟基-5-硝基苄基）溴化锍易溶于水，有利于试剂与酶作用。这两种试剂分别称为Koshland试剂和Koshland试剂Ⅱ，它们还容易与巯基作用，因此，修饰色氨酸残基时应对巯基进行保护。

七、酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰

酪氨酸残基的修饰包括酚羟基的修饰和芳香环上的取代修饰。苏氨酸和丝氨酸残基的羟基一般都可以被修饰酚羟基的修饰剂修饰，但是反应条件比修饰酚羟基严格些，生成的产物也比酚羟基修饰形成的产物更稳定（图3-7）。

四硝基甲烷（TNM）在温和条件下可高度专一性地硝化酪氨酸酚基，生成可电离的发色基团3-硝基酪氨酸，它在酸水解条件下稳定，可用于氨基酸的定量分析。苏氨酸和丝氨酸残基的专一性化学修饰相对比较少。丝氨酸参与酶活性部位的例子是丝氨酸蛋白水解酶。酶中的丝氨酸残基对酰化剂，如二异丙基氟磷酸酯，具有高度反应性。苯甲基磺酰氟（PMSF）也能与此酶的丝氨酸残基作用，在硒化氢的存在下，能将活性丝氨酸转变为硒代半胱氨酸，从而把丝氨酸蛋白水解酶变成了谷胱甘肽过氧化物酶。

八、甲硫氨酸甲硫基的修饰

虽然甲硫氨酸残基的极性较弱，在温和的条件下，很难选择性修饰。但是由于硫醚的硫原子具有亲核性，所以可用过氧化氢、过甲酸等氧化成甲硫氨酸亚砜。用碘乙酰胺等卤代烷基酰胺使甲硫氨酸烷基化（图3-8）。